东京大学相干拉曼散射显微镜，探究活体裸藻的代谢异质性

近年来，微藻因其在生物燃料、功能食品和医药领域的应用潜力而备受关注。然而，传统的分析方法难以有效解析单个活细胞的代谢特征，阻碍了对其生理多样性的深入理解。日本东京大学与多家机构合作，开发了一种基于相干拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）显微技术的无标记成像方法，可在视频速率下（27帧/秒）实时获取Euglena gracilis的代谢图谱。该技术通过检测细胞内特定化学键的振动信号，实现对代谢物分布的高时空分辨率成像，无需荧光染料或其他外源标记物。

SRS 技术：突破传统的成像新方案

在过去十年间，微藻生物材料在食品、医药、塑料和能源等领域备受关注。纤细裸藻作为其中的明星物种，既能产生可用于治疗疾病的β-1,3-葡聚糖（paramylon），又能积累可替代化石燃料的脂质。然而，想要高效生产这些生物材料，就必须快速无创研究不同环境下的代谢变化。但传统分析方法，如质谱、色谱、库尔特计数、荧光激活细胞分选和荧光显微镜等，都存在各自的局限性，无法满足研究需求。

为解决传统方法的困境，日本东京大学与多家机构合作，在《自然·微生物学》发表的最新研究中，提出了一种革命性解决方案——相干拉曼散射显微镜（SRS），首次实现了活体裸藻代谢物的无标记、视频级成像，为解析微藻代谢异质性提供了全新工具。SRS是一种光学光谱方法，比自发拉曼散射灵敏度更高，能实现高速拉曼图像采集。研究人员搭建的SRS显微镜，可在特定光谱区域获取高分辨率图像。为实现对运动的纤细裸藻无模糊成像，他们优化成像参数，减少光谱点数、缩小视野，最终使代谢物成像帧率达到每秒27帧，能在37毫秒内完成对运动细胞的无运动伪影、非侵入性成像。

图1. 使用相干拉曼散射 (SRS) 显微镜对E. gracilis进行无标记视频速率代谢物成像

a、SRS显微镜示意图。b、以30和110fps 的速度在不同FOV中采集拉曼图像 c、在91个光谱点处对固定E. gracilis进行成像。d、在四个光谱点处对固定E. gracilis进行成像。e、以每秒27个代谢物图像帧的视频速率对运动的 E. gracilis细胞进行无运动伪影代谢物成像。c–e中的比例尺为10µm。

SRS 显微镜：工作原理与成像特点

• 光源与脉冲：由钛宝石和自制Yb光纤脉冲激光器产生泵浦与斯托克斯脉冲序列，泵浦光790nm，斯托克斯光1015-1045nm可调。

• 信号处理：两束光聚焦细胞引发SRS过程，泵浦光信号经检测、解调获得SRS信号。

• 成像方式：扫描光束获取二维图像，改变波长得彩色堆栈图，不同视场和帧率下像素数不同。

• 伪影情况：交叉相位调制产生的伪影可忽略不计。

研究团队对108个活体裸藻细胞进行氮缺乏胁迫实验，通过SRS成像揭示了以下规律（图2）：代谢重编程：随胁迫时间延长，细胞优先积累副淀粉（第5天较第0天增加2.8倍）和脂质（增加1.5倍），而叶绿素含量显著下降（减少40%），表明光合作用减弱、储能代谢增强；群体异质性：即使在同一培养条件下，个体细胞代谢水平差异显著（如副淀粉含量标准差达35%），部分“超常积累”细胞（outliers）可能为突变体筛选提供线索。

图2. 不同培养条件下活E. gracilis细胞的统计分析

该方法适用范围广，不仅可用于多种有细胞壁的微藻，像Hamakko caudatus、Gungnir kasakii 和Gloeomonas anomalipyrenoides ，还能检测其他代谢物，如各类聚合物、类胡萝卜素、多糖（淀粉、直链淀粉、凝胶多糖）。此外，成像系统能获取微藻细胞三维代谢物图像，利于精确量化代谢物含量，且二维和三维定量结果相关性强。

展望：高效筛选与精准生物制造

SRS显微技术不仅适用于Euglena gracilis，还可拓展至其他微藻种类，如具细胞壁的绿藻、蓝藻等。未来，该技术可用于高通量筛选高产代谢物的突变株，为精准生物制造提供有力工具。随着显微成像和光谱分析技术的持续发展，我们有望进一步揭示微藻代谢网络的复杂性，从而推动生物能源、医药和食品科学的跨学科创新。

参考文献：

Wakisaka Y, Suzuki Y, Iwata O, et al. Probing the metabolic heterogeneity of live Euglena gracilis with stimulated Raman scattering microscopy[J]. Nature Microbiology, 2016, 1(10): 1-4.

本文转载自“微藻未来”公众号。