技术前沿丨相干拉曼散射显微成像技术的发展与应用——从技术革新到生命科学突破

相干拉曼技术作为无标记化学成像领域的核心工具，近年来持续引发国际关注（图1）。2025 年，其相关研究成果多次登上Nature子刊，在肿瘤精准切除、代谢疾病机制解析等领域展现突破性应用，标志着该技术已从实验室走向临床转化的关键阶段。其核心优势在于无需荧光标记即可实时追踪分子振动指纹，为生命科学研究提供了“化学显微镜”般的独特视角。

图1 谢晓亮教授、程继新教授多篇文献登顶Nature子刊

01  相干拉曼技术起源：从CARS到SRS的创新脉络

1999 年，谢晓亮团队在太平洋西北国家实验室（PNNL）首次报道3D相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜，通过两束激光的频率差匹配分子振动频率，实现了无标记生物成像（图2）。这一技术如同“光学手术刀”，首次在微观尺度揭示分子化学分布，但受限于皮秒染料激光的复杂性，早期应用主要局限于物理化学领域。

图2 相干拉曼过程能级示意图

2005 年，Ji-Xin Cheng教授（谢晓亮团队前博士后）在CARS光损伤机制研究中，意外发现拉曼共振增强的光热效应。这一现象虽聚焦热效应，却为后续技术革新埋下伏笔—— 研究团队意识到，通过检测激光能量转移而非热信号，可更直接地反映分子振动特性。由此，新一代相干拉曼散射技术——受激拉曼散射技术（SRS）应运而生，通过优化激光调制与信号检测，灵敏度较CARS 提升10-100倍，且彻底规避了非共振背景干扰。

02  技术发展历程与核心突破

1）硬件革新：从科研设备到临床工具的跨越

• 2008 年：速度革命

Freudiger 团队引入MHz频率调制技术，结合锁相放大器分离信号与噪声，将成像速度提升至“视频级”（每秒数十帧），首次实现活细胞内脂质合成的动态追踪（Science, 2008）。这一突破如同为显微镜装上“高速摄像机”，让实时观测生命过程成为可能。

• 2010-2014 年：便携化与成本优化

钛蓝宝石激光器逐步被光纤激光器取代，设备体积缩小50%，成本降低60%。2014 年，首个便携式SRS探头诞生，可直接用于手术台边的肿瘤边缘检测，推动技术从实验室走向临床（Nature Medicine, 2014）。

图3 相干拉曼显微镜已应用于脑肿瘤手术能快速识别肿瘤边界

2）功能拓展：从单色成像到多维化学解析

• 光谱聚焦技术

飞秒脉冲啁啾是光谱聚焦技术的关键操作，通过对飞秒激光脉冲进行时域啁啾，使其在时间-光谱域内平行展宽，从而在脉冲重叠时保持两束光的瞬时频率差恒定，通过调节时间延迟可扫描不同拉曼频移以获取 SRS 光谱（图4）。

图4 飞秒脉冲啁啾是光谱聚焦技术的关键

• 流式细胞术应用

2019年，SRS与流式细胞术结合，实现每秒分析超1万个细胞，基于代谢指纹精准区分肿瘤干细胞与普通细胞（PNAS, 2019），为单细胞药物筛选提供了高通量平台。

图5 SRS与流式细胞术结合

3）性能提升：从微米到纳米的分辨率突破

• 单分子级灵敏度

为了提高检测灵敏度和分辨率，2017 年报道的预共振受激拉曼散射（SRS）技术实现了对工程化拉曼标签的亚微摩尔级灵敏度检测（Nature, 2017）。通过集成高灵敏度荧光检测，SRS 激发荧光技术进一步迈入单分子检测领域。将 SRS 激发荧光与受激发射损耗（STED）技术相结合，可实现横向分辨率达 180 纳米的高分辨率振动成像。等离激元增强 SRS 则提供了另一种实现单分子成像灵敏度的方法(Nat Commun ,2019)。

• 超分辨成像

现有相干拉曼技术往往基于可调谐飞秒激光系统，其波长调节范围为近红外波段，因此导致其分辨率一般在300 nm左右；而且相比可见光，其拉曼散射截面较小，从而降低了对微弱信号的检测能力。因此通过倍频实现可见光相干拉曼激发，能够提高拉曼信号强度、增强成像分辨率和提高成像灵敏度，有效解决了相干拉曼成像应用中对细胞内纳米结构成像不清晰、代谢物信号难以检测等问题。

图6 超灵敏受激拉曼技术（Nat Methods, 2025）

在提高灵敏度的基础上，超灵敏受激拉曼技术通过引入特殊噪声抑制技术来增强分辨率。在细胞成像中实现了横向分辨率和轴向分辨率的3倍以上的提高。

3  生命科学中的创新应用

图7 应用全景图

• 脂质代谢与疾病研究

在神经退行性疾病研究方面，借助相干拉曼散射（SRS）技术，利用C-H键振动成像，对阿尔茨海默病（AD）模型小鼠进行观测。如图7-c (i) 所示，可清晰看到在β-淀粉样蛋白沉积区域，脂滴出现异常积累现象，由此明确脂质代谢紊乱与神经元损伤之间存在关联。并且，该技术还能够实时追踪活细胞内脂质合成与分解的动态过程，为深入探究代谢调控机制提供了直观且有力的证据。

• 肿瘤诊断与术中导航

在肿瘤诊断领域，SRS技术发挥着重要作用。通过利用蛋白质（CH₃）和脂质（CH₂）的振动差异，能够实现无标记成像。参考图7-e (i) ，在胶质母细胞瘤手术中，SRS 可在短时间（2.5 分钟）内完成肿瘤边界的识别。肿瘤区域因蛋白质富集呈现蓝色，周围正常组织因脂质富集呈现绿色，如同为医生提供了肿瘤组织的“实时地图”，能辅助外科医生精准切除肿瘤，减少过度切除或残留风险，极大提升手术的精准性与安全性。

• 单细胞功能与代谢异质性研究

在单细胞层面，SRS 技术展现出独特优势。以大肠杆菌研究为例，依据图7-b(i) ，通过分析其CH₂/CH₃比值，可预测脂肪酸链长，从而揭示代谢工程菌株的表型异质性，助力微生物代谢研究。在干细胞研究中，利用氘代水标记结合SRS技术，能有效区分间充质干细胞向脂肪细胞分化的不同阶段，从单细胞水平解析细胞代谢活性差异，为细胞功能与代谢调控机制的研究打开新视角。

• 药物递送与穿透研究

在药物递送领域，SRS技术可用于追踪纳米药物在生物体内的行为。如图7-a (i) 所示，借助炔基标记的PLGA纳米颗粒，通过SRS成像能清晰呈现纳米颗粒穿透血脑屏障的路径。这有助于科研人员深入了解纳米药物在复杂生物环境中的分布与转运情况，为优化药物载体设计、提高药物递送效率提供关键信息，推动脑部疾病治疗药物研发的进程 。

• 活体组织动态过程监测

在活体组织研究中，SRS技术可实现对动态过程的监测。以透皮给药为例，根据图7-g (i) ，利用SRS成像追踪d6-DMSO经皮渗透路径，可清晰看到药物通过毛囊通道的优先蓄积情况，以及在不同时间穿透至皮肤各层的动态变化。这为优化透皮给药方案提供了直观依据，有助于提高药物经皮吸收效率，推动皮肤外用药物的研发与应用。

相干拉曼散射显微成像技术通过无标记、高特异性和动态成像能力，已成为揭示生命分子过程的利器。从脂质代谢到肿瘤边界识别，从单细胞分析到术中导航，SRS不断拓展其应用边界。随着技术的进一步优化与跨学科融合，其有望成为生命科学和医学研究中不可或缺的核心工具。

资料来源：

[1]Xie, X. S. (2025). 25 years of 3D coherent Raman imaging for biomedicine. Nature Methods. 

[2]Cheng, J. -X. (2025). A 20-year journey on the invention of vibrational photothermal microscopy. Nature Methods.

[3]Cheng, J. -X., Yuan, Y., Ni, H., et al. (2025). Advanced vibrational microscopes for life science. Nature Methods, 22(5), 912-927.