相干拉曼植物成像样本制备：关键要点与标准化操作方法

相干拉曼散射技术（CRS），凭借其无标记、高化学特异性及三维层析等优势，正成为解析植物细胞壁分子架构与生化分布的“利器”。然而植物组织成分复杂，在实际操作中固定剂的残留、包埋介质的干扰，或是样本太厚、透光性差，都会直接拉低相干拉曼信号的信噪比，因此，建立标准化的植物制样流程至关重要。

相干拉曼成像通用制样核心原则

相干拉曼成像（SRS/CARS）植物样本制备需严格遵循以下4项通用要求，规避信号干扰、保障成像质量：

1、规避检测窗口化学干扰

固定液、包埋剂、封片介质中大量C-H基团会产生基底干扰；测试前必须彻底漂洗去除OCT、FFA等残留。石蜡包埋切片无法用于相干拉曼成像，石蜡含大量C-H键，会造成极强持续背景干扰，完全掩盖植物目标信号，仅推荐冷冻切片、振动切片两种切片方式。

2、统一标准玻片规格

设备配套高NA水浸物镜工作距离极短，统一使用：

• 盖玻片：硼硅玻璃，防脱/超疏水处理，厚度0.16–0.19mm。

• 载玻片：1–1.2mm，尺寸25×75mm。

硼硅玻璃透光率、折射率均匀性更优，保障双光束共聚焦重合效率，直接决定成像信噪比。

3、全程维持样本含水生理状态

SRS/CARS成像需水环境保留植物组织原生结构，载玻片与盖玻片间填充足量PBS/无菌水。采用双面胶围栏腔室+紫外胶密封防水分蒸发。脱水会造成细胞壁皱缩、组织折射率偏移，光束聚焦失效、信号大幅衰减。

4、叶绿素脱除按需操作

叶绿素会产生强荧光背景，干扰SRS、CARS信号采集；仅含大量叶绿体的组织（新鲜绿叶、绿藻、幼嫩光合器官）需脱绿处理，木质根茎、成熟种子、果皮、木质化枝干等叶绿素含量极低的样本，可省略脱绿步骤。

两种适用植物切片方法操作规范

1、冷冻切片（适合快速制样、需保留组织抗原特性的植物样本）

• 取材固定：植物组织取材后立即投入FAA固定液会影响脂质检测，根据组织类型调整固定时长（幼嫩组织12h，木质化茎秆24–48h，种子/果实最长72h，每12h更换一次固定液）。

• 漂洗速冻：PBS充分漂洗去除固定液，浸入异戊烷速冻10–20s至组织通体发白。

• 包埋定型：OCT包埋剂包裹组织，放置液氮预冷金属板定型。

• 切片参数：冷冻切片机温度设置-18~-25℃，富含油脂植物组织下调至-30℃。切片厚度10–50μm。木质组织切片≤30μm，幼嫩薄壁组织≤50–100μm，叶片光合组织≤10–30μm。

• 上机前处理：PBS多次漂洗完全清除OCT包埋剂，消除C-H背景干扰；CARS成像样本需保证切片无褶皱、厚度均匀，避免局部背景波动。

2、振动切片（适合需保留细胞完整活性、脂质膜结构观测，侧重CARS脂质成像）

无需冷冻、OCT、石蜡包埋，完整保留植物细胞壁、脂质层结构，适配CH₂对称伸缩振动（2845cm⁻¹）脂质分布观测：

• 需长期保存的样本需固定和包埋：FAA固定组织12–48h，2%–4%低熔点琼脂糖包裹支撑（新鲜样本无需固定）。

• 切片参数：振动切片机振动频率50–100Hz，切片厚度10–100μm，透光性差的木质组织减薄至30μm以内。

• 后处理：50–60℃预热PBS浸泡溶解琼脂糖，充分漂洗后贴片封片。

高叶绿素植物组织专用脱绿流程（按需选用）

仅新鲜绿叶、光合幼叶、绿胚等富含叶绿体样本执行，其余组织可跳过：

• FAA固定完成后，梯度乙醇逐级脱水脱色，全程单次浸泡30min，100%乙醇延长至60min。

• 30%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%无水乙醇。

• 乙醇同步实现组织脱水、叶绿素溶解脱色双重作用，脱色完成后PBS复水再进行切片操作。

植物不同部位差异化预处理方案

• 根茎组织（木质/幼嫩根系、茎秆）

FAA固定12–48h（幼嫩12h，木质茎24–48h）；可选冷冻/振动切片；切片厚度：木质组织≤30μm，幼嫩薄壁根茎50–100μm，叶绿素含量极低，无需脱绿。

• 叶片（光合组织，高叶绿素）

取0.5cm²小块或撕取下表皮，FAA固定后必须完成梯度乙醇脱绿；切片厚度控制10–30μm，保证透光，两种切片方式均可选用。

• 种子、果实

切割成小块保证固定液渗透，FAA固定最长72h，每12h换液。果肉、绿胚含叶绿素需脱绿，成熟干燥种子无叶绿体可省略，切片厚度根据透光性调整。

样本封片标准方案（双面胶夹心法，附图示）

区分样本厚度选择封片方式：

• 切片厚度≤20μm：中性树胶或UV紫外胶直接封片

双面胶夹心法制样步骤

• 切片厚度＞20μm（植物厚组织、根茎、果实切片）：双面胶夹心密封法，步骤如下：

双面胶夹心法制样步骤

1、0.1mm厚双面胶在载玻片围出封闭矩形腔室。

2、将漂洗完成的植物组织置于腔室中央，滴加足量PBS/无菌水浸没样本。

3、缓慢平整盖上标准盖玻片，避免气泡产生。

4、盖玻片四周均匀涂抹紫外胶，紫外光固化密封，防止液体蒸发。

关键禁忌总结

• 禁止使用石蜡包埋切片：石蜡大量C-H基团会造成不可逆强背景干扰，无法采集有效拉曼信号。

• 禁止省略OCT/琼脂糖漂洗步骤：包埋剂残留直接掩盖植物脂质、细胞壁特征峰。

• 禁止高叶绿素样本不脱绿直接成像：叶绿素荧光会完全淹没目标SRS/CARS信号；低叶绿素木质、种子组织无需脱绿，简化流程。

• 禁止干片成像：植物细胞壁脱水收缩会导致成像焦点偏移、信号强度断崖式下降。

规范的样本制备是获取高质量相干拉曼（CRS）植物成像数据的前提。通过上述标准化制样流程，能够有效突破植物复杂基质的成像瓶颈，真实还原细胞壁的原生化学架构。在实际操作中，无论植物组织类型如何变化，均应严格遵循规避C-H干扰、维持水合状态等核心原则，以确保成像结果的准确性与可重复性。