5分钟带你全方位看懂相干拉曼散射成像

拉曼散射的发展历史可以追溯到1920年代，当印度物理学家Raman在研究光的散射时发现，当单色光入射到物质中时，散射光中除了有与入射光频率相同的成分外，还包含与入射光频率不同的成分，这就是拉曼散射。这一发现被认为是光谱学中的一项重大突破，并在1930年获得了诺贝尔物理学奖。

然而，由于拉曼散射的信号通常很弱，其应用受到了一定的限制。直到1960年代，随着激光技术的出现和不断发展，人们发现使用激光作为入射光可以提高拉曼散射信号的强度，从而促进了拉曼光谱技术的快速发展。例如，用于研究化学键、分子构型、材料结构、药物分子与生物大分子之间的相互作用等。

什么是相干拉曼散射?

相干拉曼散射技术（Coherent Raman Scattering，CRS）是一种光谱测量手段，用于研究分子振动和转动行为。相干拉曼散射还是一种非线性光谱技术，它结合了拉曼散射和激光干涉技术，允许高分辨率和高灵敏度地探测样品中的分子振动信息。

相干拉曼散射成像原理

传统拉曼的产生需要一束泵浦光（pump），然后会产生波长不同的斯托克信号（stokes）或反斯托克信号（anti-stokes），但是由于自发拉曼的信号微弱，采集时间需要几分钟 ; 甚至是数个小时。

相干拉曼技术利用共振效应来放大需要检测的拉曼信号，需要同时输入两束光，除了泵浦光外，还需要与斯托克斯光同频率的入射光来产生共振，当斯托克斯光束ω Stokes和泵浦光束ω Pump在样品处重合且频率差 Δω = ω Pump - ω Stokes 与分子振动频率Ω匹配时：此时泵浦光能量往往会因为受激拉曼散射效应而减弱，而斯托克斯光能量则会被放大，这两种现象又分别被称为受激拉曼损耗（Stimulated Raman Loss, SRL）和受激拉曼增益（Stimulated Raman Gain, SRG），二者都属于受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）范畴。此外还会产生一个新频率信号称为相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Raman Scattering, CARS）。因此，相干拉曼具有两种形式——SRS和CARS。

通过上述方法拉曼信号被放大，最高可至一百万倍，极大提升了图像信噪比和成像分辨率。相干拉曼具有高灵敏度、无损伤、无标记、高分辨率的特点：

• 灵敏度高，较自发拉曼高一百万倍

• 视频级成像速度，1s即可获得拉曼成像图

• 多窗口大范围相干拉曼光谱扫描

• 无荧光背景干扰，高信噪比

• 可实现3D化学成像和大视野拼图

• 多色标记，多至20个靶点分布成像

• 多模态共定位成像（双光子荧光、瞬态吸收、二次谐波）

细胞代谢领域案例

通过相干拉曼散射显微镜(SRS)来成像细胞和小鼠组织中的整体代谢活性

通过小鼠饮用含氛代葡萄糖的水可以在组织切片中通过SRS成像检测到特异条带2150 cm^-1，在后续代谢过程中可以在各个组织中检测到CD键的信号，例如肌肉，心脏，胰腺，肾脏，十二指肠和fat pad中。而且不同浓度的氘代葡萄糖的SRS信号随时间变化基本为线形，提供了量化的可能。而且可以拍摄时间序列图像追踪动态变化过程。

多光谱拉曼对线虫中脂质代谢成像

模式动物作为在体研究和药物研发的重要手段，相干拉曼的无标记无损成像方式能够帮助研究员对肿瘤成因和药物作用进行深度和在体研究。除了斑马鱼，小鼠，线虫，文昌鱼等模式动物都可以运用相干拉曼技术进行原位代谢研究。