一文搞定相干拉曼生物样本制样：制备关键要点与标准化实操全流程

相干拉曼散射成像凭借无标记、高特异性、高空间分辨率、多模态兼容的技术优势，适用于植物学、组织病理、类器官发育、细胞微观表征、微生物检测等生命科学研究领域。

区别于传统荧光成像，相干拉曼成像依托分子固有振动光谱实现成像，对样本制备的洁净度、结构完整性、背景干扰控制要求较高。不规范的制样流程易引入C–H基团背景信号、破坏样本原生结构，直接影响成像分辨率与数据准确性。

本文基于振电科技标准化生物样本制样方案，系统梳理适配相干拉曼成像的通用制样原则，以及动物组织、模式生物、类器官、细胞、微生物的标准化取材、固定、处理、切片及保存流程，为各类相干拉曼成像实验提供合规、可复用的技术参考。

一、相干拉曼成像通用制样原则

为保障相干拉曼的成像质量，所有生物样本制样需严格遵循两大核心原则，从源头规避成像干扰、保留样本真实理化特征。

1. 避免检测窗口的化学背景干扰

   固定液和包埋剂中的C–H基团可能产生明显背景信号，成像前应充分漂洗，尽可能去除OCT、PFA等残留。石蜡包埋切片原则上不用于相干拉曼成像，其中含有大量C–H键，可能产生持续而强烈的背景。脱蜡不充分还可能残留石蜡，同时有机溶剂处理可能改变样本组分。因此，组织切片优先采用冷冻切片。

2. 尽量维持样本的含水状态

   SRS/CARS成像建议在水相环境中进行，最大程度维持细胞和组织的原生结构。封片剂可能引入额外光谱背景。本方案原则上客户按对应流程提供样本即可，制样由我司提供（特殊情况除外）。

二、各类生物样本标准化制样规范

1.冷冻切片通用要求

冷冻切片适用于快速制样、需保留组织抗原性与原生分子结构的相干拉曼成像实验。对于SRS/CARS，切片平整度尤为重要。褶皱、厚度不均等情况可能导致局部非共振背景波动并影响图像质量。

• 切片厚度建议<50 μm：常规建议20–30 μm。若目标为单层细胞，厚度应根据细胞大小确定，通常≤20 μm。

• 背向2PL或SHG：推荐切片厚度50–100 μm。

• 多模态成像SRS + 2PL/SHG：则要兼顾透射和背向，切片厚度视样本情况而定。

• 成像前应使用PBS充分漂洗，以尽可能去除OCT、PFA等残留，降低C–H基团引起的背景干扰。

• 人或小鼠脑组织如需进行深度3D成像，可考虑透明化处理：新鲜或固定脑组织→50% urea（w/v）+1%β-CD1（hydroxyethyl-β-cyclodextrin），溶剂为d6-DMSO→ 60 °C 孵育5–10 min（约1 mm样本）或60 °C孵育40 min（约2 mm样本）→完成后将组织置于同种透明化溶液中进行SRS成像^[1]。

2.模式动物样本

2.1果蝇

麻醉/处死并解剖目标组织→4%PFA室温水平摇床固定15 min→PBS清洗3次，每次10 min→10%蔗糖过夜→OCT包埋并快速冷冻→冷冻切片→防脱载玻片→ SRS/CARS成像^[2]。

2.2线虫

整体固定→4%PFA固定→PBS清洗；必要时进行轻度透化→SRS/CARS成像^[3]。线虫体壁较薄，整体样本可用于相干拉曼成像。

2.3斑马鱼

• 胚胎：整体固定→4%PFA固定→PBS清洗；必要时进行轻度透化→SRS/CARS成像 ^[4]。斑马鱼胚胎卵黄富含脂质，可用于脂质相关研究。

• 幼鱼（＜5 hpf）：可进行整体或切片成像。20‑24 hpf开始出现色素形成；可在培养阶段加入PTU抑制色素生成，也可在固定后采用H₂O₂+KOH去除色素干扰。

整体成像：麻醉/处死→4%PFA固定→PBS清洗→SRS/CARS成像。

切片成像：麻醉/处死→4%PFA固定→PBS清洗→蔗糖处理→OCT包埋并快速冷冻→冷冻切片→防脱载玻片→SRS/CARS成像^[5,6]。

• 成鱼：麻醉/处死并解剖目标组织→4%PFA固定→PBS清洗→蔗糖处理→OCT包埋并快速冷冻→冷冻切片→防脱载玻片→SRS/CARS成像^[7]。

2.4 小鼠（以脑组织为例）

PBS灌流→4%PFA灌流→取脑→4%PFA，4 °C固定→PBS清洗→10%蔗糖→20%蔗糖→ 30%蔗糖→OCT包埋→快速冷冻（液氮、异戊烷、干冰或部分Cryostat自带快速冷冻功能）→冷冻切片→防脱载玻片→SRS/CARS成像^[8,9]。

固定时间参考：小块肝、肾、肿瘤组织约4–12h；心脏、肺等较厚组织约8–24h；脑组织灌流后通常再固定数小时至过夜；脊髓可固定数小时至过夜。固定温度通常为4 °C；固定液体积建议至少为组织体积的10–20倍。

切片制样：用约0.1mm厚双面胶围绕载玻片上的切片形成矩形腔室，加入PBS/无菌水后覆盖盖玻片并轻压，制成双盖玻片夹心样本，避免产生气泡。

3.类器官

3.1 固定类器官球体

类器官培养→去除基质胶→4%PFA固定→PBS轻柔清洗3次→ 4°C低温运输^[10]。

• 固定时间参考：直径<500 μm，4 °C固定2–4h；直径>500 μm，4 °C固定6–12h或过夜。

• 基质胶去除：以Dispase为例，使用基础培养基将Dispase配制为1mg/mL，37 °C预热；加入1mL/孔工作液，37 °C孵育30 min，期间可轻柔吹打辅助消化；用含血清培养基终止消化后PBS清洗3次。操作过程中应避免吹散或破坏类器官球体。

• 可选透明化：对于结构致密或直径>500 μm的类器官，如有效成像深度受限，可考虑透明化处理。

3.2 活体类器官球状

类器官置于适宜培养的体系中常温运输，尽快完成SRS/CARS成像。

3.3 类器官冷冻切片

固定后的类器官球体→30%蔗糖（必要时）→OCT包埋并快速冷冻→冷冻切片→防脱载玻片→SRS/CARS成像^[11]。

• 球体制样：在盖玻片上用约0.1 mm厚双面胶围出与球体高度相当的腔室，加入PBS后覆盖另一盖玻片并轻压，避免气泡。

• 切片制样：在载玻片上用约0.1 mm厚双面胶围出矩形腔室，加入PBS/无菌水后覆盖盖玻片并轻压，避免气泡。

上述切片样本可置于切片盒内，保存及运输，保存及运输盒如下图：

4. 细胞样本

4.1 悬浮细胞

悬浮细胞800–1000 rpm/min，室温离心3–5 min，去除培养基→PBS重悬清洗→800–1000 rpm/min，室温离心3–5 min→弃上清→4%PFA重悬，室温固定10–15 min→室温离心3–5 min→弃上清→PBS重悬并清洗2–3次→4 °C保存或低温运输→SRS/CARS成像^[12]。

细胞密度建议>1×10^6/mL；若细胞量有限，可采用较小体积PBS重悬，但建议最终体积>50μL。

• 制样：将约0.1 mm厚双面胶贴于盖玻片上，取1.5 μL样本滴加于腔室内，室温静置3–5 min，再覆盖另一盖玻片并轻压，形成双盖玻片夹心样本。

4.2 贴壁细胞

细胞培养于共聚焦皿或细胞爬片（约0.17 mm厚，直径14–20 mm）→去除培养基→PBS清洗2–3次→4%PFA，室温固定10–15 min→PBS清洗2–3次→4 °C保存或低温运输→SRS/CARS成像^[13]。细胞汇合度建议60%–80%，特殊实验目的除外。

• 制样：共聚焦皿可直接用于成像；如需更高分辨率，建议使用细胞爬片。爬片可倒扣于载玻片上的 PBS 中，避免气泡，并使用UV胶固定边缘。

5. 细菌/真菌

根据样本特性采用约10,000×g离心5–10 min，去除培养基→1 mL4%PFA/组织固定液重悬，室温固定10–15 min→约10,000×g离心5–10 min→弃上清→PBS清洗2–3次→4 °C保存或低温运输→SRS/CARS成像^[14]。

细胞/菌体密度建议>1×10^7/mL；若样本量有限，可采用较小体积PBS重悬，但建议最终体积>50 μL。

• 制样：将约0.1 mm厚双面胶贴于盖玻片上，取1.5 μL样本滴加于腔室内，室温静置3–5 min，再覆盖另一盖玻片并轻压，形成双盖玻片夹心样本。

三、样本运输与保存

参考文献

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